怎样用恒温培养箱做蛋白定量浓度实验？

1、吸弃培养皿中的培养液。

2、往培养皿中加入2ml 冷的PBS轻轻荡洗2~3次，最后一次，吸干培养皿中的PBS。

3、每个培养皿中加入70μl（以FLS细胞为例）裂解液。

裂解液的配置：

RIPA裂解液：蛋白酶/磷酸酶抑制剂混合物：RIPA裂解液（中）B液=100：1：1
（配置时实际配置的体积需比理论值高出几十微升）

4、将加入裂解液的培养皿轻轻摇晃，使裂解液与贴壁细胞充分接触，放入—70℃的冰箱，冷冻10分钟。

5、裂解完后，用干净的刮刀将细胞刮于培养皿的一处（动作要快，每个皿控制在3min），然后用枪将细胞碎片和裂解液移至1.5ml 离心管中。（整个操作尽量在冰上进行）

6、将离心管置于小型离心机上涡旋一下，然后置于4℃冰箱放置30min。（期间从冰箱拿出再进行涡旋一次）

7、将离心管放入高速离心机，于4度下12000rpm 离心5min。（提前开离心机预冷）

8、取出离心管，吸取上清液，上清液即蛋白液，对其进行定量，转移至新的1.5ml离心管。（定量需用精准的枪。）

9、对提取的上清液进行蛋白浓度的定量

蛋白定量的过程

①取干净的96孔板，进行区域选择板底扫描即读板（切勿用手触摸板底）

②首先在96孔板中加入18ul的PBS（做标准曲线的PBS）

③在18ul的PBS中加入2ul的样品

④最后在加入200ul的BCA（加入后的BCA不进行与样品的混合，而是铺在样品的上面，用吹风机除去上方的气泡）

BCA的配置： BCA试剂A：BCA试剂B=50：1

⑤放置37°恒温培养箱孵育30min

⑥读板（吸光光度值为562）

10、对剩余的样品按照体积5：1的比例加入Loading Buffer（6X）

11、将加好的样品放入离心机顺离，使离心管内壁的样品甩下。

12、将样品放入恒温金属浴锅中100℃煮7min

13、将煮好的蛋白放入—20℃冰箱中备用（在离心管壁上标记好样品名称、日期）